蛋白背景调研
实验前了解蛋白自身的属性和背景是非常重要的，一般需要查阅文献或通过预实验检测样本是否表达目的位点的磷酸化蛋白。若正常情况下样本的磷酸化水平过低或不表达，可通过物理或化学方法进行一定的刺激和诱导，正确的刺激会帮助得到最佳实验结果，值得注意的是，刺激的时间和强度也需查阅文献和进行预实验来确定。
通过数据库PhosphoSitePlus，UniProt，dbPTM查询蛋白的相应位点磷酸化情况
实验操作注意事项
1. 在磷酸化蛋白提取中的“快准冷”
快，制样快，操作快；
准，实验步骤以及各类试剂添加准确；
冷，全程冰上操作，所有试剂和实验用具均需要预冷，将磷酸化蛋白降解的可能性降到最低。同时需要添加新制蛋白酶以及磷酸化酶广谱的抑制剂，提取的磷酸化蛋白需要尽快变性蛋白并于-80℃分装保存，同时避免反复冻融导致磷酸基团的降解。
另外，为了确定观察到的磷酸化水平改变是否是由于磷酸化程度的改变，或仅仅是因为蛋白质本身表达量的改变，除了常用的内参，例如Actin以及GAPDH等，还需要添加一个总蛋白作为参照，帮助进行将结果分析。
2. Western Blot操作过程中需要注意的问题
蛋白定量后，快速将样品与上样缓冲液混合，以遏制磷酸酶活性。随后可以将样本等分并储存在低温冰箱中或直接加样进行WB检测。样本应避免长期储存，最好现配现用。
磷酸化蛋白的丰度较低，大概只有总蛋白量的10%，在实验时尽量增加上样量，避免影响实验结果与判断。有的磷酸化蛋白会特意注明上样前不要煮沸，因为煮沸可能会破坏其磷酸化位点。
封闭液：牛奶中含有大量的一种磷蛋白——酪蛋白，会引起高背景。在进行磷酸化蛋白检测时建议使用牛血清白蛋白BSA或无蛋白的封闭剂，封闭时间不宜过程，1-1.5h即可。
为尽量减少非特异性信号，用 TBST 代替磷酸盐缓冲液（PBS）。如果在中间步骤中必须使用 PBS，则应在加入蛋白检测底物前，用大量 TBST 清洗膜，以除去过量的磷酸钠。
转载：https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/50364302，https://www.bilibili.com/read/cv32324637/
